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技术资料
原位杂交实验流程
2010-6-4

原位杂交实验步骤

一质粒制备

1质粒的转化和扩增

1.1制备XL1-Blue感受态细菌

1. 取400uL XL1-Blue菌种加入到含200ml LB培养基的锥形瓶中,37 ℃100

rpm培养4h,离心,倒置,以冰冷的0.1 molL CaCl_2重悬细菌,冰浴30 min

离心,弃上清,倒置,再加4ml(15%甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌,

分装(200 μtube)-80 ℃保存。

2. 转化:在冰浴中将1XL1-Blue感受态菌解冻,将浓度为2ngμ1的质粒

DNA4μ1加入到8Oμ1感受态菌中。

3. 轻轻摇匀,冰浴30 min

442 ℃热激9O秒,然后迅速冰浴2 min

5. 加入LB培养液(无氨苄青霉素)0.8ml,在37 ℃100转/min水浴孵育

60 min

6.取200μl菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mgml)-IPTG(200mgml)

LB-氨苄青霉素50 mgml,1μlml培养基),待菌液全部被吸收后,倒置平

板于37 ℃培养12-16h

1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落

1. 用无菌牙签挑取单菌落,接种到10 ml含氨苄青霉素的LB培养液的离心管

中,于37 ℃200转/分培养2h,取1 ml之一Eppendorf离心管,加50μl

10mmolL EDTA(pH 8.0)

2. 加入50μl新配置的0.2molL NaOH0.5SDS20%蔗糖溶液后,振荡

3O秒。

3. 在70 ℃温育5 min,然后冷却到室温。

4. 加1.5μ14molL KCl0.5μ10.4%溴酚兰染液,振荡3O秒后,冰浴5

min

5. 12000g4 ℃离以 3 min,以除去细菌碎片。

6. 制备1%的琼脂糖凝胶(EB0.5μgml),取50μl上清液加入到样品孔中,

其中一孔加入中等分子量DNA Marker。恒压50V,进行电泳。

7. 当溴酚兰迁移到凝胶全长的23-34时,停止电泳,在紫外灯下检查质粒

DNA分于量的大小是否与转入质粒相符。

1.3质粒的扩增和纯化

1. 用无菌牙签分别挑取单个白色菌落移入含30ml LB-氨苄青霉素(50μgml)

培养液的聚丙烯管中,于37 ℃200转/分培养3h

2. 将菌液转入含70 ml LB-氨苄青霉素培养液的250ml锥形瓶中,37 ℃200

转/分培养过夜(12-16h),细菌浑浊。

3. 菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇,100ml菌液加入0.5ml氯霉素

溶液,终浓度为170 μml)37 ℃200转/分培养12-16h

4. 将培养的细菌倒入50ml的离心管中,6000rpm4 ℃,th,15 min,沉淀细菌。

5. 弃净上清夜,用2ml预冷的溶液I,悬浮菌体沉淀,剧烈振荡,于室温静置5 min

6. 加入新配制的溶液II 4ml,快速用手晃动10秒,颠倒数次后,于室温静置10 min

7. 加入预冷的溶液III 3ml,温和振荡l0秒,于冰上静置10 min,出现白色絮状沉淀。

8. 6000rpm4 ℃离心15 min,保留上清。

9. 将上清(若带细菌残片,则再次离心)移入另一50ml的离心管中,加入O.6

倍体积的异丙醇混匀,于室温静置10 min(-20 ℃4h,或4 ℃过夜,可

便核酸沉淀)

10.12000 rpm4 ℃离心15 min,回收核酸。小心弃去上清,倒置离心管使残

兼上清液流尽。

11.于室温用70%的乙醇洗涤沉淀物和管壁,室温12000 rpm离心,15 min

充分弃去乙醇,于室温将离心管倒置在纸巾上,使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。

12.用500μl TE(pH8.0)溶解核酸沉淀,转移至1.5 ml Eppendorf管中。

13.加入用冰预冷的5molLLiCl溶液600μl,充分混匀。12000 rpm4 ℃

15 min,以沉淀高分子量的RNA

14.将上清转移到另一1.5 ml Eppendorf管中,加等量异丙醇,充分混匀,于室

温静置10min

15.12000 rpm,4 ℃离心15 min,回收核酸。小心弃去上清,倒置离心管使残

余上清液流尽。

16.于室温用70%的乙醇洗涤沉淀物和管壁,室温12000 rpm离心,15 min

充分弃去乙醇,于室温将离心管倒置在纸巾上,使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。

17.400μl含无DNA酶的RNA(20μg/ml)TE缓冲液(pH8.0)溶解沉

淀,将溶液转移到另-1.5 ml Eppendorf管中,室温放置1.5ml Eppendorf

管中30min

18.加入400μl 13(vv)PEG 8000-NaCl(1.6 molL),混匀,4 ℃ 12000

rpm离心5 min以回收质粒DNA,弃去上清。

19.加入400μl TE缓冲液(pH 8.O)溶解沉淀,再分别用等体积的Tris饱和酚、

酚:氯仿:异戊醇(25241)、和氯仿各抽提一次。

20.将水相(上清)移入另一1.5ml Eppendorf管中,加入O.1体积(50μ13M

的醋酸钠(pH 5.2)2倍体积(大约1 ml)的无水乙醇,充分混匀后于4

放置30 min

21.于4 ℃ 12000 rpm离心5 min回收沉淀的质粒DNA。尽可能弃去上清,敞

开管口,置工作台上使残留的痕量乙醇蒸发殆尽。

22.加入400 μl处于4 ℃70%乙醇,稍加振荡,漂洗沉淀,4 ℃ 12000 rpm

2 min

23.吸去上清,室温敞开管口,直到乙醇完全挥发。

24.用100μl TE缓冲液(pH 8.0)溶解沉淀。

25.取4μl溶液1100稀释后,测定其OD260OD280,以确定质粒DNA

纯度和浓度(OD260OD280>1.8OD260OD280DNA而言其值大约为

1.8,高于2.0则可能有RNA污染,低于1.8则有蛋白质污染。;DNA浓度

=OD260 X 0.05 X稀释倍数(μgμl)

26.质粒DNA溶液于-20 ℃保存待用。

二、cRNA探针的标记

1. 将质粒DNA,用相应的限制性内切酶线性化,通过琼脂糖凝胶电泳以确保

完全线性化。

2. 线性化后的DNA质粒的纯化步骤19-24进行纯化,作为cRNA探针

标记的模板,用相应的RNA聚合酶合成地高辛标记的反义和正义RNA

针。

3. 进行体外转录,步骤如下:

4. 在冰上将各试剂加入一1.5 mlRNA酶的Eppendorf管中。

DEPC处理的三蒸水8μl

质粒DNA模板 0.05μgμl

1μl

10 x NTP地高辛标记混合物 1 x

2μl

0.1 M DTT溶液 10 mM

2μl

5 x转录缓冲液 1 x

4μl

RNAse抑制剂 2Uμl

1μl

RNA聚合酶 2U/μl

2μl

反应体系总体积 20μl

5. 加入上述各试剂后,混匀,简短离心后在37 ℃孵育2h

6. 加入2μlRNA酶的DNAI(10Uμ1)37 ℃孵育15 min降解模板DNA

7. 加入0.2M EDTA(pH 8.0)溶液2μl终止反应。

8. 加入2.5μl4 M Licl7.5μl冷的无水乙醇,混匀,-20 ℃放置2h

9. 12000g下离以 15 min,弃上清,小心地用50 μl冷的70%乙醇洗涤沉淀。

1O.室温下稍干燥,溶于100μ1 DEPC处理过的三蒸水中,混匀分装,-20 ℃

保持备用。

三、原位杂交

3.1冰冻切片与杂交前预处理

1. 将子宫样品从-80 ℃取出,用OCT包埋,在-23 ℃(切片机腔体温度)平衡

至少30 min。将包埋好的样品固定在样品头上,切10μm厚的连续组织

切片,平铺于涂有多聚赖氨酸(1mgm1)的玻片上(玻片预先经180 ℃

6小时),保存于-70 ℃冰柜备用。

2. 冰冻切片经室温干燥10 min后,在4%的多聚甲醛-PBS(pH 7.4)固定lO

min

3. 活跃的DEPC-PBS(未高压的0.1DEPC-1XPBS溶液)2次,每次5 min

4. 在0.2M的盐酸作用中作用10 min后,重复步骤4)

5. 在切片上滴加蛋白酶K(0.1μgm1)37 ℃孵育15 min,重复步骤4)

6. 经0.1M TEA(三乙醇胺)作用5min后,再在新配制的0.25AA0.1M TEA

(乙酸酐/三乙醇胺,pH 8.0)中乙酰化10 min

(在大多数实验中,步骤456省略)

7. 5 x SSC中平衡15 min

3.2杂交

8. 在脱水后的玻片上滴加预杂交液(100 μl/玻片),置于放有湿盒液(50

甲酰胺vv0.3 M NaCl1Mm EDTA10 mM Tris-ClpH 8.O)的湿盒中,

5558 ℃下的烘箱中预杂交2 h

9. 甩掉预杂交液,地高辛标记的反义或正义cRNA探针(浓度1-2ngμl)

70 ℃变性1O分钟,置冰上1 min,玻片上滴加预杂交液(60μl/玻片)

覆盖parafilm膜,放湿盒中在4858 ℃下杂交18-30 h

3.3杂交后处理

1O.取出玻片,小心去掉Parafilm膜,甩掉杂交液,用52 ℃预热的5×SSC

30 min

11.在无DNARNAA(20μgml)溶液中37 ℃下孵育30 min

12.分别依次用52 ℃预热的2 X SSC1 X SSCO.1 X SSC2次,每次30 min

3.4杂交信号检测

13.在缓冲液A(0.1M Tris-HC 1 pH 7.50.15M NaC1)中平衡5min

14.在玻片上滴加碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(15001:2000稀释于含0.5

阻断液的缓冲液A),室温反应2h

15.用缓冲液A2次,每次15 min

16.在缓冲液B(0.1M Tris-HCl0.1M NaCl0.05M MgCl_2pH 9.5)中平衡5

min

17.硝基四氮唑蓝(NBT)5--4--3-吲哚氧磷酸盐(BCIP)溶于缓冲液B

中,每ml缓冲液B含有4.5μ1 NBT3.5μ1 BCIP。在玻片上滴加混合染

液在湿盒中显色过夜。

18.充分显色后,用EDTA(1 mM EDTApH 8.0)15 min终止反应。

19.在95%乙醇中洗l h以除去非特异的背景。

20.用蒸馏水洗15 min除去可能存在的结晶体。

21.脱水、透明,用中性树胶封片。

22.充分干燥后在显微镜下观察、照相。

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